[HPLC 이론] 순상 HPLC VS 역상 HPLC의 차이점은?

제약회사에서 이화학 시험 시 가장 많이 쓰이는 대표적인 분석장비는 HPLC가 있습니다.

 

이번 포스팅에서는 HPLC의 기본 개념인 순상 HPLC와 역상 HPLC에 대해 알아보겠습니다.

실제 제약회사 QC면접에서도 직무면접에서 자주 묻는 개념이니 이번포스팅을 통해 확실하게 알아가시길 바랍니다.

 

1. HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석 시 영향을 미치는 요소

HPLC의 대표적인 모습은 아래 사진과 같습니다.

출처 : Waters 홈페이지

HPLC에는 여러 구성요소가 있는데 이 중 분석에 영향을 줄 수 있는 대표적인 요소는 1. 이동상 2. Column입니다.

HPLC의 이동상은 액체로 주로 유기용매 혼합물이나 Buffer를 사용합니다.

(이동상이 액체이므로 Liquid Chromatography라고 부릅니다.)

 

Column은 혼합물에서 단일성분을 분리할 때 사용하며, Column의 스테인리스관 내부에  Resin(사진 속 흰색 다공성 물질)이라고 하는 고분자 물질의 특성에 따라 혼합물을 분리할 수 있습니다.

출처 : YMC 홈페이지

 

2. HPLC 기본 원리

시료가 HPLC 내부에 주입되면, 시료 속 성분이 HPLC 구성요소인 이동상 및 컬럼과 상호작용하여 혼합물속에서 단일성분으로 분리가 되어 나오게 됩니다.

이때, 분리되어 나오는 시간을 머무름시간(Retention time - RT)이라고 합니다. 흔히 RT라고 부릅니다.

칼럼내부 Resin과 성질이 비슷할수록 상호작용으로 인해 천천히 분리되므로 RT가 길어진다고 보시면 됩니다.

3. 순상 HPLC(Nomal phase)와 역상 HPLC(Reverse phase)의 차이

순상과 역상은 이동상과 Column의 특성에 따라 나눌 수 있으며, 각 조건은 아래와 같습니다.

 

 

순상 HPLC는 이동상은 비극성용매, 칼럼은 극성 Resin을 사용하는 분석조건을 말합니다.

비극성용매로 사용하는 대표적인 용매로는 Isopropyl Alcohol과 Hexane이 있으며, 비극성 용매를 적절히 혼합하여 사용하기도 합니다. 적절한 비율로 혼합하는 이유는 용매종류에 따라 비극성정도가 다르므로 혼합 비율에 따라 분석성분의 RT가 달라질 수 있기 때문입니다.

극성 Resin은 컬럼 Resin에 붙어있는 화학물질 작용기가 NH2, SiOH로 이뤄진 칼럼을 말합니다.

 

반면, 역상 HPLC는 이동상은 극성용매, 컬럼은 비극성 Resin을 사용하는 분석조건을 말합니다.

극성용매로는 메탄올, ACN과 같은 유기용매를 물과 적절한 비율로 혼합하여 사용하거나 인산완충액과 같은 극성물질로 이루어진 Buffer를 사용하기도 합니다.

비극성 Resin은 컬럼칼럼 Resin에 붙어있는 화학물질 작용기가 C18처럼 알킬기로 이뤄진 칼럼을 말합니다.

 

일반적으로 HPLC 분석 시 극성물질을 주로 분석하므로 역상 HPLC를 많이 사용합니다.